【摘要】：[目的]考察利用聚酰胺分离纯化巫山淫(Epimedium wushanese T.SYing)羊藿中淫羊藿苷的工艺条件和参数。[方法]采用聚酰胺柱色谱法,以10%～40%乙醇水溶液进行梯度洗脱,分离富集淫羊藿苷,并配以HPLC进行同步监控。[结果]不同体积分数的乙醇洗脱液对淫羊藿苷的洗脱能力不同,淫羊藿苷在30%乙醇水溶液中得到了分离富集,含量可达17.22%,收率为95.97%。[结论]采用聚酰胺柱色谱法能有效分离巫山淫羊藿中淫羊藿苷,且操作简单,重复性好。

【关键词】： 巫山淫羊藿淫羊藿苷 聚酰胺色谱法

     淫羊藿为小檗科淫羊藿属植物，分为淫羊藿(Epimedium brevicomum Maxim．)、箭叶淫羊藿[Epimedium sagittatum (Sieb．et Zucc．)Maxim．]、柔毛淫羊藿(Epimedium pubescens Maxim．)，巫山淫羊藿(Epimedium wushaense T．S．Ying)和朝鲜淫羊藿(Epimedium koreanum Nakai)，其干燥地上部分均为原料药材。淫羊藿味辛、甘，性温，归肝、肾经，可补。肾阳，强筋骨，祛风湿，用于阳痿遗精、筋骨痿软、风湿痹痛、麻木拘挛、更年期高血压等症。淫羊藿的主要有效成分是淫羊藿黄酮(淫羊藿苷、淫羊藿次苷)，其总黄酮具有增加心脑血管血流量、促进造血、抗肿瘤、抗氧化、增强机体免疫力和骨代谢等功能 一 。淫羊藿总黄酮的提取与分离前人有所研究，但其重要成分淫羊藿苷的分离纯化报道较少，且多采用硅胶柱色谱¨ 和多级逆流萃取 。聚酰胺是分离纯化黄酮类化合物非常有效的填料，且价格低廉，适宜工业化生产。为此，笔者采用聚酰胺色谱法分离纯化淫羊藿中的淫羊藿苷，并优化其工艺条件和参数，为更好地提取与分离淫羊藿中淫羊藿总黄酮提供新的途径。

1 材料与方法

1．1 材料

1．1．1 主要仪器。Agilent．1100高效液相色谱仪(自动进样)；Mettler Toledo AL204型电子天平；旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂生产)；DZF-250电热真空干燥箱(郑州长城科工贸有限公司生产)；中压色谱柱(2．5 cm x70．0 am)；HL·2B 恒流泵(上海青浦沪西仪器厂生产)。

1．1．2 主要试剂。淫羊藿苷标准品(购于中国药品生物制品检定所)；聚酰胺(60—100目，台州市路桥四甲生化塑料厂生产)；乙醇(分析纯)；乙腈(色谱纯)；巫山淫羊藿[购于四川，经遵义医学院杨建文副主任药师鉴定为巫山淫羊藿 (Epimedium Wlsharlel~e T．S．Ying)]。

1．2 方法

1．2．1 聚酰胺的预处理及回收。聚酰胺于95％ 的优质工业乙醇中煮沸30 min，过滤，再次置于95％ 的优质工业乙醇中煮沸，重复3次。使用过的聚酰胺用5％ 的氢氧化钠溶液浸泡4 h，水洗至中性。

1．2．2 淫羊藿苷的提取。称取淫羊藿枝叶，剪碎，加入6o％乙醇回流提取3次，每次2 h，过滤，回收乙醇得黄色浸膏。浸膏在真空干燥箱中60℃ 下干燥至恒重，经HPLC测定淫羊藿苷的含量为3．97％。

1．2．3 淫羊藿苷的分离纯化。取经处理过的聚酰胺，水浸润后湿法装柱。精密称取淫羊藿提取物1．496 1 g，少量热水溶解后加入到色谱柱中，并被聚酰胺吸附。调整恒流泵使柱流速为1 d／s，采用水和10％ 、20％ 、30％ 、40％ 乙醇溶液进行梯度洗脱。分段收集从10％ 乙醇开始洗脱的洗脱液，每份1 个柱体积，HPLC在线监测化学成分流出情况，根据化学成分含量的变化改变洗脱液的浓度。收集含有淫羊藿苷的洗脱液，经0．45 m过滤膜过滤后直接进行检测，相同部分进行合并，浓缩，60℃ 减压干燥，即得淫羊藿苷样品。

1．2．4 淫羊藿苷含量的测定。

1．2．4．1 色谱条件。色谱柱：Agilent Eclipse XDB—C18色谱柱(250 mm×4．6 mm，5 lxm)；流动相，乙腈一水(30：70)；检测波长，270 am；流速，1．0 ml／min。

1．2．4．2 对照品溶液制备。精密称取淫羊藿苷对照品5．0 mg，置于50 Hll量瓶中，用甲醇溶解，定容至刻度，即得。

1．2．4．3 供试品溶液制备。精密称取淫羊藿苷样品0．281 0 g，置于100 ml量瓶中，用甲醇溶解定容至刻度，即得。

1．2．4．4 线性关系考察。设淫羊藿苷对照品溶液的进样量依次为1、2,4、8、l2 1，按“1．2．4．1”的色谱条件进行测定，记录色谱峰，以峰面积Y对质量数 ( g)进行线性回归计算，得回归方程。

1．2．4．5 精密度试验。精密吸取对照品溶液8 ，重复进样5次，记录淫羊藿苷的峰面积和相对标准偏差(no)。

1．2．4．6 稳定性试验。精密吸取淫羊藿苷样品溶液1 ，分别于0、2、4、6、8、10 h进样测定，记录峰面积和RSD。 2 结果与分析

2．1 洗脱剂的选择前期试验以盐酸一镁粉为显色剂检测发现，在用不同浓度乙醇梯度洗脱淫羊藿提取物时，浓度大于40％以后基本已经没有黄酮成分流出。采用HPLC考察淫羊藿提取物中的黄酮成分组成情况，结果见色谱图1，淫羊藿苷标准品色谱图见图2。由图1、2可知，淫羊藿苷为提取总黄酮中极性最低的一个。因此，采用的洗脱剂为水和10％一4|D％ 的乙醇溶液进行梯度洗脱。

2．2 线性关系考察结果回归方程为：y=973．2x一4．1，r= 0．999 8，线性范围为：0．096～1．152 Ixgo 2．3 精密度试验结果淫羊藿苷峰面积的平均值为751， RSD=0．55％，表明仪器的精确度良好。

2．4 稳定性试验结果淫羊藿苷峰面积平均值为501，RSD = O．9o％，表明供试品溶液在10 h内基本稳定，测量结果无明显变化。

2．5 不同浓度乙醇洗脱液中淫羊藿苷的含量测定结果 由图3～5可知，收集10％ 乙醇洗脱液6个柱体积，20％ 乙醇洗脱液7个柱体积，30％乙醇洗脱液l1个柱体积；40％ 乙醇洗脱液中已无黄酮成分，不收集。可见，淫羊藿苷(出峰时间 7．096 min)主要富集在30％ 的醇洗脱液中。

2．6 淫羊藿苷含量和总收率的测定由表1可知，分离纯化后淫羊藿苷的含量为l7．22％ ，收率为95．97％。

3 结论与讨论

采用聚酰胺分离纯化巫山淫羊藿中的淫羊藿苷，用水、 10％ ～40％ 乙醇水溶液进行梯度洗脱，10％ 乙醇洗脱液6个柱体积，20％ 乙醇洗脱液7个柱体积以上的用量可有效除去杂质，30％ 乙醇洗脱液l1个柱体积用量能富集绝大部分淫羊藿苷。该方法操作简便、重复性好，可用于生产。

聚酰胺能与不同黄酮类化合物形成强弱不等的氢键，即 “氢键吸附”学说，是分离黄酮最有效和最常用的填料之一。

该研究结果表明，水和10％ 、20％ 乙醇能很好地将非淫羊藿苷的黄酮部分除去，此时，淫羊藿苷还没有流出；30％乙醇能得到绝大部分淫羊藿苷，计算得出该部分淫羊藿苷的含量为 17．22％ ，收率达到95．97％ ，说明淫羊藿苷得到了很好的分离和富聚，而且没有因为聚酰胺的吸附造成很大的损失。